Цитата:
Сообщение от 123456789
Здравствуйте! Давно наслышан высоком уровне микробиологии и цитологии в Удомле, в связи с чем собственно и хочу посоветоваться. Пишу в общий раздел, т.к не нашел раздела микробиологии на этом форуме, что неудивительно.
|
И Вам доброе время суток, незнаю кто вам посоветовал Удомлю как центр микробиологических исследований но людей разбирающихся здесь в ней действительно много, хоть это и не так афишируется
С удовольствием отвечу на ваши вопросы
Цитата:
Сообщение от 123456789
Я пока пользуюсь fugene от roche, методика у него длинная и странная. Уверен, что она не оптимизирована по трудоёмкости. А скорее наоборот - трудоёмкость во внимание не принималась.
|
Я не совсем понимаю, что вы вкладываете в понятие трудоёмкости относительно используемого реагента.
Если вы о смешивании содержимого пробирок А и Б, то у липофектамина трудоёмкость гораздо выше
Цитата:
Сообщение от 123456789
На днях заказал трансфекционный реагент от Сигмы ESCORT IV  , ещё не пробовал |
Мы в конце концов остановились на TurboFect (Fermentas), стоит дешевле остальных, эффективность трансфекции на том же уровне. Протокол - стандартный.
У нас 293 трансфецировались Fugene хуже чем всеми остальными.
Цитата:
Сообщение от 123456789
Ещё деталь: как быстро клетки набирают плазмиду? Пишут, что 24-72 часа с липофектамином - это правда?
Можно ли, скажем, трансфицировать сразу при посеве?
|
Клетки "набирают" плазмиду в течении нескольких часов. Всё, конечно, зависит от плазмиды, но в большинстве случаев экспрессию белка видно на блоте уже через 12 часов, максимальную - через 48. Люциферазный эссей вообще можно делать через несколько часов после трансфекции.
Трансфекция при посеве называется обратной, то есть, да, можно, любым реагентом.
Цитата:
Сообщение от 123456789
А насколько важно чтобы 293 клетки не достигали насыщения? Опять же мне достаточно 30% еффективности, если можно использовать уже достигшие насыщения клетки, то насколько бы это было меньше мороки...
|
Большинство реагентов для трансфекции токсичны и часть клеток всегда умирают, именно для этого рекомендуется высокая плотность (50-70%). При более низкой плотности относительная смертность просто будет больше, вот и всё.
Теоретически если клеток слишком много, эффективность должна уменьшится, так как уменьшается доступная площадь поверхности мембраны (при прямой трансфекции). С какого-то момента клеткам становится тесновато, накапливается слишком много продуктов жизнедеятельностив среде, начинается контактное торможение, понижается метаболизм, втч и синтез вашего белка и т.д. Так что я бы не рекомендовал, особенно если не просто трансфецируете скажем для ко-айпи, а с целью исследовать какой-то клеточный процесс.
В общем, после сколько-у-вас-там дней трансфекции цвет среды должен быть красно-оранжевым, но не доходить до ярко-жёлтого. Если критично растить клетки при высокой плотности, лучше среду обновлять, это немного помогает
Цитата:
Сообщение от 123456789
Говорят, что липосомный реагент лучше замешивать в стеклянной пробирке а не в эппендорфе, это правда? или теоретические домыслы? |
Большинство реагентов сильно липнут к пластику, к разным типам по разному. Одноразовые стерильные стеклянные пробирки - это будет весьма дорого. Производители рекомендуют использовать полистиреновые, у нас они работают хорошо.