о трансфекции 293х клеток
 

Здравствуйте! Давно наслышан высоком уровне микробиологии и цитологии в Удомле, в связи с чем собственно и хочу посоветоваться. Пишу в общий раздел, т.к не нашел раздела микробиологии на этом форуме, что неудивительно.

Кто сталкивался с наладкой трансфекции эукариотических клеток плазмидами, расскажите, как лучше и легче это делать?

Я пока пользуюсь Fugene от Roche, методика у него длинная и странная. Уверен, что она не оптимизирована по трудоёмкости. А скорее наоборот - трудоёмкость во внимание не принималась.

На днях заказал трансфекционный реагент от Сигмы ESCORT IV :yahoo:, ещё не пробовал.

Поскольку всё равно буду менять методику, так лучше сразу попрововать оптимизированный вариант, чтобы полегче и побыстрее...
Клетки у меня сейчас 293 и C3H.
Плазмиды много, эффективность меня беспокоит не очень, в смысле, что стабильные 30% меня устроят, главное чтобы нетрудоёмко и воспроизводимо.

Ещё деталь: как быстро клетки набирают плазмиду? Пишут, что 24-72 часа с липофектамином - это правда?
Можно ли, скажем, трансфицировать сразу при посеве?

Говорят, что липосомный реагент лучше замешивать в стеклянной пробирке а не в эппендорфе, это правда? или теоретические домыслы?:)

А насколько важно чтобы 293 клетки не достигали насыщения? Опять же мне достаточно 30% эффективности, если можно использовать уже достигшие насыщения клетки, то насколько бы это было меньше мороки...

Тебя хоть в "зацени" копипасть...

И Вам доброе время суток, незнаю кто вам посоветовал Удомлю как центр микробиологических исследований но людей разбирающихся здесь в ней действительно много, хоть это и не так афишируется :)
С удовольствием отвечу на ваши вопросы

Я не совсем понимаю, что вы вкладываете в понятие трудоёмкости относительно используемого реагента.:-? Если вы о смешивании содержимого пробирок А и Б, то у липофектамина трудоёмкость гораздо выше

Мы в конце концов остановились на TurboFect (Fermentas), стоит дешевле остальных, эффективность трансфекции на том же уровне. Протокол - стандартный.
У нас 293 трансфецировались Fugene хуже чем всеми остальными.

Клетки "набирают" плазмиду в течении нескольких часов. Всё, конечно, зависит от плазмиды, но в большинстве случаев экспрессию белка видно на блоте уже через 12 часов, максимальную - через 48. Люциферазный эссей вообще можно делать через несколько часов после трансфекции.

Трансфекция при посеве называется обратной, то есть, да, можно, любым реагентом.


Большинство реагентов для трансфекции токсичны и часть клеток всегда умирают, именно для этого рекомендуется высокая плотность (50-70%). При более низкой плотности относительная смертность просто будет больше, вот и всё.
Теоретически если клеток слишком много, эффективность должна уменьшится, так как уменьшается доступная площадь поверхности мембраны (при прямой трансфекции). С какого-то момента клеткам становится тесновато, накапливается слишком много продуктов жизнедеятельностив среде, начинается контактное торможение, понижается метаболизм, втч и синтез вашего белка и т.д. Так что я бы не рекомендовал, особенно если не просто трансфецируете скажем для ко-айпи, а с целью исследовать какой-то клеточный процесс.
В общем, после сколько-у-вас-там дней трансфекции цвет среды должен быть красно-оранжевым, но не доходить до ярко-жёлтого. Если критично растить клетки при высокой плотности, лучше среду обновлять, это немного помогает

Большинство реагентов сильно липнут к пластику, к разным типам по разному. Одноразовые стерильные стеклянные пробирки - это будет весьма дорого. Производители рекомендуют использовать полистиреновые, у нас они работают хорошо.

В том форуме, откуда Вы скопировали заумные фразы, значения которых наврядли понимаете есть и ответы на эти вопросы, которые Вы тоже наврядли поймёте. Стоит ли засорять основной раздел форума?

Прошлогоднюю траву на даче лучше не жечь, а закладывать в компостную яму, иначе, особенно если стоять по ветру при сжигании, могут возникать подобные вопросы...

...А где у Вас дача? ::)